DH10BAC 感受态细胞
产品特性
| 产品名称： | DH10BAC 感受态细胞 |
| 单位： | 支 |
| 规格： | 10×100 μl / 20×100 μl |
| 运输条件： | 干冰 |
| 基因型： | F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalKλ-rpsLnupG/pMON14272/pMON7124 |
| 菌株抗性： | 卡那霉素抗性 |
| 储存条件： | -70℃保存，运输为干冰包装。-70℃保存至少 6 个月，避免反复冻融。不适合在液氮中保存。 |
产品简介
大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞，适用于昆虫杆状病毒 Bac-to-Bac 系统中同源重组的菌株，用于产生重组 Bacmid。DH10Bac 细胞包含亲本 Bacmid bMON14272 和辅助质粒 pMON7124 。亲本Bacmid 包含一个 mini-F 复制子、卡那霉素抗性基因、att Tn7 位点和 lac Zα-互补因子。辅助质粒包含 tns ABCD 区域，该区域提供了mini-Tn7从供体质粒插入亲本Bacmid 靶位点所需要的转座蛋白。供体如 pFastBac 系列质粒（pFastBac1，pFastBacDual 等）含有 Tn7R 和 Tn7L 同源重组臂，Tn7R和 Tn7L 之间包含庆大霉素抗性基因、昆虫病毒多角体基因启动子、多克隆位点和 SV40 病毒的PolyA 加尾信号。当含有靶基因 pFastBac 的重组质粒转化到 DH10Bac 细胞后，发生重组后就可产生重组 Bacmid，提取纯化重组 Bacmid 转染昆虫细胞 Sf9 或 Sf21 就可以包装产生昆虫病毒。此外，DH10Bac 细胞中的 The φ80dlacZΔM15 基因的产物可以实现β-半乳糖苷酶的α-互补现象，用于重组Bacmid 的蓝白斑筛选。大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞是经特殊工艺制备，使用 pUC19 质粒检测，转化效率可达 107 cfu/μg。
操作方法
（以下操作均按无菌条件的标准进行）
1. 取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。
2. 向感受态细胞悬液中加入 1-10ng 重组质粒，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置 30 分钟。
3. 将离心管置于 42℃水浴中放置 90 秒钟，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 2 分钟，该过程不要摇动离心管。
4. 向每个离心管中加入 900μL 无菌的 SOC（不含抗生素），混匀后置于 37℃ 200rpm，摇床振荡培养 4 小时。
5. 用 SOC 培养基进行 10 倍梯度稀释，如分成 3 个稀释梯度 10-1，10-2，10-3。
6. 取 100μL 的各个梯度的培养物用于涂布。等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，37℃培养 24-48小时。
7. 保留剩余的菌液于 4℃冰箱中，视平板上菌落生长情况决定去留。
注意事项
1、感受态细胞应保存在-70℃，不可反复冻融，否则其转化效率将会降低。
2、实验过程中应严格无菌操作，防止其它 DNA 或杂菌的污染，避免为以后的筛选、鉴定带来影响。
3、转化时，转化效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源 DNA 量过多或体积过大反而会降低转化效率。转化时 DNA 体积要小于感受态细胞体积的十分之一。
4、转化率的计算：转化率＝产生菌落的总数/铺板 DNA 总量。
5、为防止转化实验不成功，可以保留部分连接产物，以重新转化，将损失降到最低。
